follow us login

一、crispr/cas简介


crispr的全称是clustered regularly interspaced short palindromic repeats(成簇规律间隔的短回文重复序列),形如其名,crispr 序列结构正是成簇的规律间隔的短回文重复序列,该序列与crispr associated(cas)蛋白组成crispr/cas系统。crispr/cas系统是原核生物的一种自我保护机制,也是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。
crispr 诊断被称为下一代分子诊断技术,主要利用 rna 来检测血液或尿液等生物液体中的生物标志物,包含样本前处理(含预扩增)、靶标识别、信号释放和检测几部分。
其发挥免疫的功能包括适应、表达和干扰3个阶段。
在适应阶段,细菌通过cas蛋白(cas1和cas2)捕捉入侵的外来核酸,并整合至自身基因组的crispr 序列中形成记忆功能,以便下次出现入侵时,细菌可启动免疫反应;
在表达阶段,crispr 序列转录生成前体crrna (pre-crrna)和反式激活rna(trans-activating crrna, tracrrna),pre-crrna通过加工,形成含有与外来基因序列匹配的crrna,crrna与tracrrna通过碱基配对形成向导rna(single-guide rna,sgrna),用于cas蛋白的募集;
在干扰阶段,sgrna引导cas蛋白定位到与其同源的外来核酸靶标,并激活cas蛋白的内切酶活性,对靶标核酸进行切割,从而发挥免疫功能。
crispr在1987年首次被发现, 直到最近几年crispr-associated(cas)诊断技术得到的广泛应用,离不开两位大牛,麻省理工的张锋和加州大学伯克利分校的jennifer doudna。两人不但在crispr基因编辑上做出奠基性贡献,也对crispr在分子诊断行业的应用做了开拓性工作。正是两位大牛在2015~2018这四年的你来我往交锋中,开启了crispr分子诊断这一全新领域。
国外最早于2016年发现的酶是cas13 跟 cas12a的酶,并在2018年发表基于cas13 跟 cas12a的酶的检测技术。
2020年的诺贝尔化学奖颁给了crispr的奠基者emmanuelle charpentier和上面提到的jennifer doudna,crispr技术被誉为会改变和造福人类的发明。crispr/cas技术在基因治疗、合成生物学,疾病模型和科学研究方面的应用如爆发的火山,一发不可收拾。
2022年,nature发布年度值得关注的技术榜单,其中crispr-cas诊断检测被列为其中之一,通过cas12酶或者cas13酶的特征,可检测广泛的病原体,乃至有效地诊断其他非感染性疾病。目前国内外的公司借助crispr检测技术已经可以在30分钟内实现针对病原的快速、准确的检测。
迄今为止,基于crispr的诊断主要应用在传染病的检测。2022年8月4日,伦敦帝国理工学院和博德研究所的研究人员开发了一种易于使用的 crispr 检测技术,这项新检测技术通过检测生物标志物,在室温下能够更快地诊断心脏病和癌症等非传染性疾病,且操作简便。相信假以时日,crispr 检测技术在遗传性疾病、其它非传染性疾病和癌症检测上一定会大放异彩。
二. crispr检测原理

2015年,上述两个团队发现了crispr的新酶,可以进行非特异性的切割,crispr检测技术便由此展开。

crispr诊断的原理就是:当待检体系中存在靶标核酸时,cas蛋白在向导rna的引导下特异识别靶标序列,形成复合物,进而被激发出针对单链rna的“附带切割活性“,将体系中的荧光标记探针切碎,发出荧光信号,完成检测过程,通过检测体系是否发光来判断靶标核酸是否存在。
crispr/cas系统反式切割活性的检测技术所用的cas蛋白主要有cas12、cas13和cas14,这类蛋白除了具有特异性切割靶序列的功能外,在激活状态下,还具有非特异性切割其它核酸序列的功能。在没有激活的状态下,cas蛋白保持沉默,不会胡作非为;
一旦被激活,便会进行非特异性切割其他携带荧光信号的核酸序列,也就是对非靶标核酸进行切割,像一个没有感情的收割机,高举镰刀,看到韭菜就要割,被割下的一茬茬绿油油韭菜,释放荧光信号,即是可用来检测的信号。
cas12在crrna引导下即可识别靶标dsdna,并靶向富含t的pam位点,对靶序列进行特异性切割,同时附带非特异性切割ssdna的活性。靶标核酸经等温(rpa或lamp)扩增富集,然后扩增产物与cas12-crrna结合,激活cas12的附属切割功能,对ssdna荧光探针进行切割,释放荧光基团,形成检测信号。

image.png

cas13是一种rna引导的rna核酸内切酶,可在crrna的引导下特异性切割单链靶标rna,并在完成切割后,可继续保持活性并切割其他非靶标rna。靶标核酸经等温扩增技术rpa扩增并引入t7启动子序列后,再利用t7 rna聚合酶转录形成ssrna,转录产物与cas13a-crrna结合,激活cas13a核酸酶活性,切割ssrna荧光探针,释放可被检测的荧光基团。
image.png
image.png
基于crispr-cas13系统的核酸检测模式
基于cas蛋白的这个特点,张锋和jennifer doudna各自创立了对应的体外诊断公司,专注于开发与crispr/cas系统相关的体外诊断技术及产品。

三.未来可期

crispr/cas系统具有作为疾病和病原体检测诊断工具的潜力。大多数已报道的 crispr/cas生物传感系统具有高分辨率(单碱基分辨率)、高灵敏度(达到amol 级)、低成本( 1美元以下)、操作简易(裸眼判读的试纸)、易储存(室温下储存一年以上)的优点。

具有反式切割活性的三种cas蛋白(cas12、cas13和cas14)被激活后,可对非靶标核酸进行切割,将检测信号进一步放大,提高了检测灵敏度,同时grna对靶序列的特异性识别,进一步提高了检测特异性,使得crispr/cas诊断系统具有高灵敏度、高特异性的特点。不同特性cas蛋白的发现,丰富了检测核酸类型的选择,从dsdna到ssdna再到rna,均可作为crispr/cas分子诊断系统的靶序列,结合层析技术等显色反应,还可实现检测结果的可视化,为分子poct领域的应用场景带来了无限可能。

image.png

tiosbio宝盈同汇双靶标核酸检测试纸条

作为一种可特异性识别靶序列,具有催化放大信号功能,可直接对靶标序列进行检测的技术,按目前的检测方法,大多需要预先扩增 rna 靶标来放大信号,这增加了操作步骤,耗时也更长了。

另外crispr/cas系统的反式切割活性具有随意性,对实现定量和多靶标检测有一定难度。现有cas蛋白大部分依赖于pam序列发挥作用,对靶标序列的选择受到限制。作为一种基因编辑技术,其脱靶效应的存在也会影响到诊断结果的准确性。

但是,crispr/cas系统作为下一代诊断技术的引领者,相信国内外研究者能改进驾驭这个技术,使其更趋近于理想的诊断技术。未来可期!

参考资料 :https://mp.weixin.qq.com/s/2jqr5eth1trgy1wdpvpyrg;https://mp.weixin.qq.com/s/20alfr-wmvtwuzxn8p2vpq



contact us

feel free to call us on
025-85998075

our email

drop us a line anytime at
,
and we’ll get back soon.

our address

come visit us at 2 qiande road, life science high tech zone, jiang ning district, nanjing, jiangsu province, china

网站地图