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约30%人类癌症与ras突变有关。ras家族有3种亚型,即kras,hras和nras。kras已成为人类癌症中最常出现突变的基因之一,在多种癌症如胰腺癌、肺癌和结肠癌等均发现kras蛋白被上调或被突变激活。多年来,针对kras突变抗癌药物的临床活性并不乐观。安进公司利用kras突变产生的半胱氨酸残基成功开发上市了共价抑制剂amg510,使kras再次成为新药研发热点。本文以小分子与kras蛋白的相互作用模式为依据,将kras小分子抑制剂分为直接作用抑制剂和间接作用抑制剂,综述了各类抑制剂的代表结构、作用机制和生物活性研究进展,为kras小分子抑制剂抗肿瘤新药的开发提供思路和方向。



正文

癌基因ras是首个被发现的人类癌基因,主要有 kras,hras 和 nras 3 种亚型。ras突变引发的癌症约占人类癌症的30%,而kras基因突变占 ras 基因突变总数的 85%(nras 占12%,hras占3%),kras也被誉为癌症治疗的“靶点之王”。


kras蛋白具有低疏水性,经过法尼基化修饰后可克服自身低疏水性,结合到细胞膜内侧。通常,kras在细胞内以无活性的kras-鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate,gdp)形式存在,在受体蛋白酪氨酸激酶受到刺激信号刺激后,可招募下游鸟嘌呤核苷转换因子(guanine nucleotide exchangefactors,gef)。在 gef作用下,kras释放 gdp,并迅速与鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,gtp)结合,以活性形式 kras-gtp存在。kras蛋白自身具有 gtp 酶活性,在 gtp 酶激活蛋白(gtpase-activating proteins,gap)调控下活性增强,可将结合的gtp水解为gdp,使kras-gtp转变为无活性的kras-gdp。kras正是通过这种非活性状态(与gdp结合)和活性状态(与gtp结合)之间的切换,发挥二元开关的作用。这个过程在正常细胞中虽非常缓慢,但大多数kras突变会抑制gtp水解,影响kras-gtp向kras-gdp转换,进而引起kras功能异常激活,引发癌症。


针对这一调控机制,设计开发直接作用于kras的抑制剂,进而抑制其功能的异常激活,即成为新药研发的重要思路。也可针对 kras细胞分布及其活性增强的调控,设计间接作用于kras的抑制剂。如抑制kras释放gdp的一种鸟苷释放蛋白激活剂 sos1(son of sevenless 1,sos1)抑制剂、影响 kras 分布的法尼基转移酶抑制剂和kras作用于下游效应物的含src同源2结构域(src homology 2 domain contain⁃ing protein tyrosine phosphatase,shp2)抑制剂等,都是重要的间接作用于kras的抑制剂。


kras参与调控3条重要信号通路:迅速加速纤维肉瘤激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma,raf)/丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activatedprotein kinase kinase,mek)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,erk)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-4,5-bispho⁃sphate 3-kinase,pi3k)-蛋白激酶b(protein kinaseb, akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian tar⁃get of rapamycin,mtor)和 ral/鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(ral/gdp dissociation stimulator,ral/gds)。因而也可以设计作用于kras下游相关效应物的间接抑制剂。本文对直接作用抑制剂和间接作用抑制剂的代表结构、分子机制和生物活性研究进展进行综述。


1 直接作用于kras的抑制剂

kras是拥有 gtp酶活性的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,主要由1个gtp酶催化结构域和紧随其后的高度可变区域组成(图1) ,其直接靶向抑制剂主要包括:① 直接作用于gtp酶活性位点的鸟苷类似物;② 直接作用于开关ⅱ口袋的抑制剂;③ 其他方式直接作用于kras的抑制剂;④ 基于蛋白降解 靶 向 嵌 合 体(proteolysis targeting chimeras,protac)技术靶向诱导kras突变蛋白降解。性位点的竞争性可逆抑制剂的开发长期未能取得突破,kras一度被认为是“不可成药靶点”。


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hunter等和chen等报道的sml系列化合物能与kras的gtp酶活性位点发生不可逆共价结合,很好地解决了竞争性可逆抑制剂对 gtp酶活性位点结合能力弱的问题。sml系列化合物是一种gdp类似物,含有一个从β磷酸盐延伸出来的亲电弹头,经过迈克尔反应加到cys12上,形成一个稳定的硫醚键,研究发现,sml 阻止了 kras与下游效应物raf的结合。但该类化合物作为竞争性不可逆抑制剂在ras不同亚基之间的选择性仍然是化合物结构设计的挑战。该类抑制剂的代表化合物sml-8-73-1(1,图2)在1 mmol·l -1 gdp/gtp环境中,与 kras g12c 的结合率超过 95%,抑制肺癌细胞 h358 增殖的 ic 50 值为26.6 μmol·l -1 。

1.1 作用于gtp酶活性位点


kras突变主要发生在gly12,gly13和gln61残基上,而这3个氨基酸处于kras蛋白发挥gtp酶活性的催化位点,突变后对kras蛋白的gtp酶活性影响显著,因此找到可与kras的gtp酶活性位点结合的小分子抑制剂,对抑制kras异常激活意义重大。早期的 kras抑制剂开发思路即是寻找能竞争性结合kras的gtp酶活性位点的鸟苷类似物,但由于ras各亚型中gtp酶结构域的序列和结构几乎相同,各亚型之间很难做到高选择性;且kras与gdp/gtp的亲和力常数达pmol水平,而细胞中 gtp浓度在 mmol水平,小分子药物很难对kras进行竞争性结合;同时kras蛋白表面缺少有利于小分子结合的空腔,使基于gtp酶活boumelha等于2021年在美国癌症研究学会上报道了化合物rm-032,该分子可与 kra sg12c和亲环蛋白 a 共价结合,抑制 kras g12c肿 瘤 细胞中 ras通路信号传导和细胞增殖。rm-032具有口服利用度高、体外对细胞增殖抑制明显的特点,但其详细结构未见报道。


1. 2 作用于开关ⅱ口袋


1.2.1 作用于kras g12c突变型

2013年,janes等首次报道了利用小分子共价结合kras g12c突变体的可行性。对于krasg12c型的突变,突变产生的半胱氨酸(c12)残基与相邻的组氨酸95(h95)残基产生了一个易于靶向的狭窄口袋开关ⅱ口袋,可提供稳定的药物-蛋白质相互作用位点。小分子通过不可逆共价结合于此“口袋”,可将kras g12c锁定在非活性状态,从而影响肿瘤细胞的增殖扩散,而不破坏未突变kras 的正常功能。由于开关ⅱ口袋的发现和不可逆共价结合技术的发展,使得直接靶向kras抑制剂的研发重新成为热点,直接靶向kras的小分子不可逆共价抑制剂不断被报道。


安进公司研发的amg510(2,图3)是第一个进入临床研究的kras共价抑制剂,在30 min内可缓慢地将kras-tgp转换为kras-gdp。amg510分子与 kras g12c共结晶(图 4)显示,其母核喹唑啉酮占据 kras 开关ⅱ口袋,丙烯酰胺部分与c12形成共价键,吡啶环的取代基(异丙基)与y96,h95和q99紧密接触,很大程度上填充了h95残基的侧链旋转产生的口袋。此时,kras蛋白gtp酶活性位点无法再容纳3个磷酸基,与gtp的结合力大大降低,同时也会阻碍gef催化gtp替换gdp的过程,将kras g12c锁定在结合gdp的非活性状态,阻止肿瘤细胞增殖扩散.


阿达格拉西布(adagrasib,mrtx849)是另一种可口服的 kras g12c 小分子共价抑制剂(3,图3),具有与amg510相同的作用机制。该化合物的上市申请已于2022年2月15日向美国食品药品管理局(fda)提交,用于治疗kras g12c突变且此前接受过至少1次全身治疗的非小细胞肺癌患者。


国内外其他公司基于开关ⅱ口袋作用机制设计开发的kras g12c共价小分子抑制剂化学结构见图 3,其体外细胞增殖抑制活性见表 1。其中贝达、信达、先声、劲方药业和首药控股的研制的该类化合物细胞增殖抑制活性ic 50 值达几十nmol水平,其他公司的小分子抑制剂紧随其后,均表现出良好的抑制活性。


1.2.2 作用于kras g12d突变型

kras g12d突变也是人类恶性肿瘤中最主要的变异之一,研究可抑制kras g12d的小分子抑制剂对治疗恶性肿瘤具有极高的价值。清华大学张永辉团队报道的针对kras g12d突变的抑制剂th-z816(18,图5),具有与kras g12c抑制剂截然不同的结构和作用机制。对 th-z816 与kras g12d 的共晶结构研究发现,kras g12d化合物结合口袋也由开关ⅱ口袋(红色)、p-环(蓝绿色)和α2-螺旋(绿色)等蛋白结构组成(图6a)。th-z816的萘基部分深深嵌入开关ⅱ口袋中,与残基val9,met72,phe78,gln99,ile100和val103形成疏水相互作用,同时还与残基 his95,glu62,gly60 和 asp12 之间也有 4 对极性相互作用(图6b)。突变体中asp12的羧酸基在生理条件下脱去质子后带负电荷,与碱性的、带正电荷的哌嗪基团形成正、负电荷相互吸引的盐桥。这种正、负电荷之间的强盐桥相互作用类似于建筑结构中的榫卯结构,使蛋白与小分子药物像榫和卯一样牢固连接(图 6c)。这种结合也“挤压”了 kras g12d 的gtp酶活性位点,使其结合gtp的能力大大降低,从而抑制kras因突变产生的过度活化,这一发现为kras g12d抑制剂的开发提供了很好的思路。相较针对kras g12c突变开发的不可逆共价抑制剂,盐桥在提供牢固的结合力的同时也使这种结合具有可逆性。因此,以这种作用机制开发的抑制剂属于变构位点的可逆抑制剂。

在张永辉团队之前,最早报道的kras g12d可 逆 抑 制 剂 是 mirati therapeutics 公 司 研 发 的mrtx1133(19,图 5),其具有与 th-z816 相同的哌嗪结构,并与其作用机制类似。该化合物对kras g12d 的 抑 制 具 有 选 择 性 和 可 逆 性 ,对kras 野生型细胞无影响。在胰腺癌和结直肠癌的动物荷瘤模型上均显示出对 kras依赖性信号的持续剂量依赖性抑制,且在 3 mg·kg -1 水平即可有效抑制 g12d 突变型移植瘤生长,但至今未见其进入临床研究的报道。我国恒瑞医药披露,其针对 kras g12d 开发的抑制剂 hrs-4642 注射液于 2022 年 7 月 26 日获批临床,无疑成为国内 kras g12d 抑制剂药物研发的先行者,但未见其化合物结构的报道。同时,国内加科思公司的化合物 20(图 5)和南方医科大学陈建军团队的化合物 kd8(21,图 5)也是含哌嗪结构的抑制剂。



1.3 其他方式直接作用于kras


kessler等开发的bi-2852(22,图7a),结合在 kras上的开关ⅰ口袋和开关ⅱ口袋间的特殊口袋中。其与 kras的活性或非活性形式结合的亲和力达nmol水平。晶体结构研究发现,bi-2852与kras的活性形式kras-gtp结合时,开关ⅰ口袋(图7b浅绿色)口袋和开关ⅱ口袋(图7b浅红色)口袋相较于与非活性形式kras-gdp结合时均显著减小。通过这种特定的结合方式,不但阻断kras-gdp 与 sos1 之间的相互作用,也抑制kras-gtp与其下游效应物raf和pi3k之间的相互作用,这导致 gdp 到 gtp 的交换被抑制,gap催化的gtp到gdp的交换也被抑制,从而可很好地抑制nci-h358肿瘤细胞增殖 。bi-2852最终虽未能成药,但证明了开关ⅰ口袋和开关ⅱ口袋确实是可能的结合位点,给抑制kras药物的开发提供更多可能。


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1.4 kras-protac抑制剂


protac技术是利用小分子化合物诱导靶向蛋白降解的技术。protac分子是一种双功能小分子,一端结合靶蛋白的配体,另一端结合e3泛素连接酶的配体,结构中 2 个配体之间通过连接子(linker)相连。其在体内可将靶蛋白和e3酶拉近,使靶蛋白被打上泛素标签,然后通过泛素 — —蛋白酶体途径降解靶蛋白。bond等报道了(23,图 8),它是第一个能够降解内源性 krasg12c的 protac 分子,lc-2 用阿达格拉西布弹头与 kras g12c 共价结合,并招募 e3 连接酶vhl,从而诱导快速而持续的 kras g12c 降解,导致纯合和杂合 kras g12c 细胞系中 mapk 信号通路的抑制;在 nci-h2030 细胞中,lc-2 很好地 诱 导 了 内 源 性 kras g12c 降 解 ,ic 50 值 为(0.59±0.20)μmol·l -1 。protac 技术虽起步较晚,但因其在药物开发上的独特优势而备受关注,加之kras抑制剂研究日益广泛,该类降解剂的报道也不断涌现。li等报道的化合物kp-14(24,图8)与lc-2具有类似的结构,其对nci-h358细胞增殖的ic 50 值为17.41 μmol·l -1 。


2 间接作用于kras的抑制剂

kras在胞内信号传递通路中处于关键位置,通过阻断 kras上、下游信号转导,可开发出多种间接抑制kras的小分子化合物。主要包括:影响kras 在细胞中正常分布小分子抑制剂,抑制kras 释放 gdp 的 sos1 抑制剂,抑制 kras 脱磷酸化的 shp2 抑制剂和抑制kras调控的下游信号通路的抑制剂等。



2.1 影响kras在细胞中正常分布的抑制剂


2.1.1 法尼基转移酶抑制剂

法尼基化是存在于真核细胞中的异戊二烯化修饰形式,它可以修饰蛋白并使其锚定到胞膜上。实体瘤增殖与转移中常见法尼基转移酶的参与,且与转移酶的活性有关。通过抑制法尼基转移酶的活性,可以阻断 kras蛋白法尼基修饰,切断其与 细 胞 膜 结 合 路 径 ,从 而 抑 制 肿 瘤 细 胞 的 增殖。替吡法尼(tipifarnib,r115777)(25,图 9)是选择性抑制法尼基转移酶的小分子抑制剂,基于乳腺癌和肾癌的适应证的开发处于临床ⅱ期试验阶段,基于胰腺癌适应证的开发处于ⅲ期临床试验阶段。


2.1.2 pde-δ δ靶向降解剂

kras为了到达质膜,其法尼基化的高变区与pde-δ的穿梭因子结合。cheng等报道了第一类 pde-δ 降解物化合物 26(图 9)。该化合物与pde-δ结合,并有效地诱导pde-δ降解,最终诱导kras突变体sw480和hct116细胞的凋亡,并在体内、外对kras突变的结直肠癌细胞均表现出明显的抗增殖能力,对 sw480 细胞增殖的 ic 50 值为(8.0±2.7)μmol·l -1 ,对hct116细胞增殖的ic 50 值为(8.0±3.6)μmol·l -1 。



2.2 sos1抑制剂


sos1蛋白是一种在细胞中广泛表达的调控蛋白,作为信号通路中的关键蛋白,其在细胞内许多信号转导通路中起重要调控作用。sos1是gef和ras的激活剂,可在变构位点结合kras-gtp,从而增强gef功能,构成正反馈调节,其缺失或其gef 功能特异性基因失活已被证明会降低携带kras突变的肿瘤细胞存活率。研发有效且选择性sos1 抑制剂将与 mek 抑制剂协同作用,从而在kras驱动癌症中产生强大且持续的通路阻断和良好的抗肿瘤功效,成为kras小分子抑制剂的研究方向。


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bi-3406(27,图9)是一种高效、高选择性、高口服生物利用度的小分子sos1抑制剂。该抑制剂可和 sos1 催化结构域结合,从而阻断 sos1 与kras之间相互作用。bi-3406可抑制肿瘤生长,在mia-paca-2 荷瘤小鼠中,每日 2 次给予 bi-340650 mg·kg -1 与曲美替尼(trametinib)0.125 mg·kg -1 ,可在长达10 h内持续抑制肿瘤细胞的增殖;该化合物代谢约24 h后,mia-paca-2肿瘤的erk磷酸化水平恢复到基础水平。由于 sos1 在所有肿瘤类型中均表达,其抑制剂 bi-3406 可广泛应用于kras突变引起的肿瘤治疗。



2.3 shp2抑制剂


shp2磷酸酶由ptpn11基因编码,参与多种细胞致癌信号级联反应,是第一个报道的致癌磷酸酶。shp2可直接使kras脱磷酸化,增强其与效应蛋白raf的结合,从而激活下游mek/erk信号通路。tno155(28,图9)是诺华制药公司通过优化吡嗪类变构开发的shp2抑制剂,其对shp2的ic 50 为0.011 mmol·l -1[60] ,tno155可抑制ras/raf/erk 信号通路,并且在小鼠和大鼠中的口服生物利用度分别为 78% 和 86% 。jab-3068(29,图9)是由加科思制药公司开发的shp2的小分子抑制剂,可干扰 mapk 信号通路,抑制表达shp2 的肿瘤细胞增殖。nichols 等报道了shp2 的小分子抑制剂 rmc-4550(30,图 9),其ic 50 为0.583 nmol·l -1 ,可通过抑制kras蛋白的活性阻断ras/erk信号通路和肿瘤生长。shp099(31,图9)也是一种有效的shp2抑制剂。shp099的极性官能团和离子官能团暴露,显著提高了其选择性和口服生物利用度,其对 erk磷酸化的ic 50 为0.07 mmol·l -1。



2.4 抑制ras/raf/mek/erk信号通路的抑制剂


在抗癌药物研究信号通路筛选中,癌症细胞生长以及侵袭和转移等过程均有 ras/raf/mek/erk通路参与。由于该信号通路负责细胞增殖,因此通过研究小分子抑制剂将期阻断成为重要的研究方向。在ras/raf/mek/erk信号通路中,mapk表达异常是判断癌症发生的标志,目前阻断kras突变肿瘤的策略主要集中在抑制下游mapk信号转导。索拉非尼(sorafenib)(32,图 10)是可口服的、可进行多靶点治疗的kras小分子抑制剂。通过作用于raf/mek/erk/信号通路,其可直接抑制信号转导,从而阻止肿瘤细胞增殖。可比替尼(cobimetinib,gdc - 0973)(33,图 10)是mek/akt双通路抑制剂,该化合物的杂氮环丁烷及酰胺键增加了细胞代谢稳定性,可通过抑制kras g13d和b-raf g464v突变从而抑制肿瘤发生。



2.5 抑制pi3k/akt/mtor信号通路的抑制剂


布帕利西(buparlisib,bkm120)(34,图10)是一种广谱 pi3k 抑制剂,作用于 p110α,p110β,p110δ 和 p110γ 时,ic 50 值分别为 52,166,116 和262 nmol·l -1 。bez-235(35,图10)是咪唑并喹啉衍生物,是 pi3k 和 mtor 的小分子抑制剂 。利用bez-235对p0α,p0γ,p0δ,p0β和mtor作用时,ic 50 值分别为4,5,7,75 和20.7 nmol·l -1 。另外研究显示,bez-235在临床上可抑制晚期乳腺癌细胞增长,对实体肿瘤也具有治疗作用。bez-235抑制pi3k和mtor突变,阻断pi3k/akt/mtor信号通路,抑制肿瘤细胞抑制肿瘤细胞的恶性增殖。临床证明,该药可维持糖代谢稳定,增强肿瘤细胞对细胞毒性药物如长春新碱等的敏感性。


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2.6 抑制ral/gds/ral信号通路的抑制剂


鸟嘌呤核苷酸交换因子,具有直接和特异性催化gdp/gtp交换能力,从而促进其活性信号状态,减少ral a/b与鸟苷核苷酸亲和能力,有利于结合gtp。ral/gds/ral信号通路负责细胞因子释放,能促进ral蛋白gdp/gtp转换。ral由ral a和ral b亚型组成,ral a对肿瘤生长起重要作用,而ral b在肿瘤转移和侵袭中起重要作用。通过抑制 ral/gds/ral 通路可抑制 ral 下游效应信号通路。研究发现,二氢吡咯环衍生物p61a6(结构未报道)可有效抑制非小细胞肺癌异种移植模型中肿瘤细胞增殖,p61a6对h358,和h1507细胞的ic 50 值为5~15 μmol·l -1。


3 结语与展望

kras蛋白具有独特的结构特点,由于表面相对光滑且口袋腔较浅,与药物分子结合存在一定难度,一度被认为是“不可成药”的靶点。近年来共价抑制剂技术的发展以及对kras结构认识的深入,特别是 amg510 发现以来,直接或间接靶向抑制kras突变的小分子抑制剂相继出现,使kras成为抗癌药物热门研究靶点。国内外已有多家企业聚焦基于kras靶点的创新药开发,申报临床的有十余种,前景值得期待。其中再鼎医药从 mirati公司引进的阿达格拉西布进度较快,的 gf-105、加科思jab-21822、d-1553、贝达药业bpi-421286和恒瑞医药hrs-4642等均已进入临床研究。先声、济民可信的化合物均处在非临床药学研究,细胞增殖抑制活性均达到nmol水平,其他公司的小分子抑制剂也紧随其后,均表现出良好抑制活性。目前,kras小分子抑制剂的研究重心主要是针对 kras g12c。随着研究的深入,针对kras g12d与kras/sos1相互作用的抑制剂及kras降解剂也将不断涌现。同时,目前研究结果显示,kras靶向药物与其他免疫药物或靶向药物联用具有更突出效果,如阿达格拉西布与pd-1抗体潘利珠单抗(pembrolizumab)联用治疗携带kras g12c突变的非小细胞肺癌患者,ⅰ期临床试验结果显示疾病控制率达到100%。此外,protac技术凭借其独特优势将在针对kras靶点的药物开发中发挥出巨大潜力。


因kras突变导致的肿瘤种类较多,从适应证等方面来看,kras是十分值得深入广泛研究的癌症治疗靶点,但目前国内针对该靶点的小分子药物研究同质化严重。就已公布的小分子化合物看,结构差异不大,适应证集中,作用效果相当,这可能导致最终的新药申报、临床选用和市场占有出现十分激烈的竞争。目前 kras g12c 不可逆抑制剂amg510已上市,阿达格拉西布已递交上市申请,二者的ic 50 值在40~100 nmol·l -1 ,临床用药剂量较大,其中后者临床有效剂量为600 mg,amg510>960 mg,且amg510已出现耐药性。因此,发现活性更高、生物利用度更好的新化合物仍具有重要意义。提高化合物的耐药性也将是 kras抑制剂未来发展的挑战和机遇。




作者:焦龙华1,2 ,田从魁 1,2 ,王胜超 1,3 ,王永广 1,4 ,郜红利 1,2 ,史伯安 1,2


机构:

1.湖北民族大学武陵山天然药物研究所,湖北 恩施 445000

2. 风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室,湖北 恩施 445000

3. 宜昌东阳光长江药业股份有限公司,湖北 宜昌 443000

4. 苏州施安鼎泰生物医药技术有限公司,江苏 苏州 215000

来源:中国药理学与毒理学杂志2023年3月第37卷第3期




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