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从技术上看,分子诊断领域主要包括pcr(传统pcr、qpcr和dpcr)、荧光原位杂交(fish)、基因芯片和第二代高通量测序技术(ngs)等。其中,pcr是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台,在国内分子诊断中市占率高达40%;其次是分子杂交技术,占比为35%。

1. 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)

上世纪八十年代,cetus corporation公司的化学家kary mullis发明了pcr,对分子生物学乃至整个生命科学界产生了巨大的推动作用。从此以后,基于pcr的dna扩增技术逐渐成为生物学研究的基础,开启了一个又一个生命科学领域的重大课题。目前,pcr在传染性疾病(细菌、真菌、病毒、支原体)诊断、nipt、干细胞研究、生物标志物开发等方面有着极为广泛的应用。

pcr是指在dna多聚酶(又称“dna聚合酶”,如taq dna聚合酶)催化条件下,以母链dna为模板,以特定引物为延伸起点,通过高温变性(94℃)、低温复性(55℃)、中温延伸(72℃)等步骤,在体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程。pcr是生物体外的特殊dna复制,最大的特点是能将微量的dna大幅扩增。

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图:pcr原理

与杂交技术、高通量测序技术相比,pcr技术主要优势在于高灵敏度、易于推广,主要局限在于检测位点单一且已知,多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。但从短期来看,pcr技术仍将是分子诊断主流技术平台。

pcr技术自问世以来,经历了三十余年的高速发展,目前已经成为世界上应用最成熟、市场份额最大的分子诊断技术平台。研究者们在该技术原理基础之上开发出一系列衍生的分子检测技术,主要可以分为三类:第一代pcr电泳法、第二代荧光定量pcr(qpcr)和第三代数字pcr(dpcr)

1.1 pcr电泳法(传统pcr)

pcr电泳法是最原始、最简单的基于凝胶的低通量pcr方法,是指在pcr反应结束之后,通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法,利用长波式紫外灯照射或放射自显影技术对pcr扩增产物进行定性检测分析的dna检测方法。但pcr电泳法本身只能做定性检测而无法定量,因为该反应产出的dna量不一定能反映最初情况,例如不同样品和序列的扩增效率是有差异的。此外,还存在交叉污染、检测耗时长等缺点,目前处于衰退期,基本上已被淘汰。


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图:pcr电泳条带图

1.2 qpcr电泳法(荧光定量pcr)

qpcr是利用插入性染料或荧光探针对pcr产物进行标记跟踪,通过监控整个pcr过程中荧光信号的强度变化得到待测dna样本初始浓度的相对定量分析方法。该方法相较于传统pcr方法而言,无需取出pcr产物进行分离,且可作定量分析,并具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、无污染等优势,目前已逐渐取代常规pcr,成为应用最成熟、临床应用最广泛的分子诊断技术平台。


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图:pcr标准曲线定量分析待测dna样本浓度

根据引入荧光基团的不同,qpcr可分为荧光探针法定量pcr和荧光染料法定量pcr。

荧光探针法定量pcr的原理为:在pcr反应体系中,加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在dna任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;pcr扩增时,taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条dna链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步,这就是定量的基础所在。

荧光染料法定量pcr的原理为:在pcr反应体系中,加入过量荧光染料,该染料只与双链dna小沟结合并发射荧光信号,并不与单链dna链结合,而且在游离状态不发出荧光,从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步,此即定量的基础所在。

qpcr在国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台,尤其是在感染性疾病(hbv、std等)和肿瘤伴随诊断领域,目前仍以qpcr技术平台为主。据不完全统计,截至2020年5月11日,国家药监局(nmpa)共批准了806个pcr类产品,其中荧光定量qpcr产品占比高达85.11%。在伴随诊断领域,nmpa获批的伴随诊断产品中有60%都是基于qpcr技术,而fda批准的39个伴随诊断产品基于qpcr技术的产品占比也高达38.46%(15个)

1.3 dpcr(数字pcr)

dpcr是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术,主要采用当前分析化学热门研究领域的微滴化方法,对待测样本进行高倍稀释,分配到不同的反应单元内,每个单元或不含有、或含有一至多个目标分子(dna模板),再将所有反应单元内的样本进行pcr扩增,最后结合泊松分布原理,分析软件根据阳性分子个数与比例得出靶分子的起始拷贝数(copies)或浓度(copies/ul)。与qpcr相比,dpcr具有绝对定量、高灵敏度、可耐受pcr反应抑制物、减弱背景序列干扰信号等显著优势。


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dpcr在国内尚处于市场导入期,目前仅有南京科维思生物的her2基因扩增检测试剂盒(数字pcr法)获批,在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传染病检测、nipt、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文数据显示,中国dpcr行业市场规模从2013年的14.6亿元增加至2017年的72亿元,cagr达到29.2%,到2022年市场规模预计将达到266.6亿元。

2.  荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,fish)

fish是一种按照核酸碱基互补配对原则,利用荧光素标记的、已知序列的dna探针直接原位杂交到待测dna样本模板上,经荧光检测系统和图形分析技术对待测dna序列进行定位、定性和相对定量的技术。fish主要用于指导肿瘤靶向药物使用、肿瘤预后、肿瘤疾病分型诊断、nipt等领域,是检测her-2基因(一种原癌基因)状态的金标准,目前在国内发展较为成熟,且国内大多数省份和地区均已将其纳入医保。

fish操作流程为:首先用荧光素(直接标记法)或“生物素-荧光素标记亲和素”放大系统(间接标记法)标记探针核苷酸,利用切口平移法或随机引物法制备出带有荧光标记的、已知序列的dna探针。在高温条件下使该探针与待测dna样本模板发生变性并打开双链,令两者混合杂交并形成杂交体,最后通过荧光显微镜进行观察,从而实现对目标dna的定性、定位和相对定量分析。

3 基因芯片技术

基因芯片技术又称dna微阵列技术,是将大量荧光或酶标记的、序列已知的dna探针集成在同一芯片上与样品分子进行杂交,通过采集荧光或化学发光信号获得样本序列信息。基因芯片技术可看作是fish与芯片技术的结合,可以实现对大量目标基因同时进行检测,具有成本相对较低、检测效率较高的优势,主要应用于消费级基因检测、病毒分型、耐药突变位点检测、遗传基因和肿瘤基因检测等领域。

ngs又称为下一代测序技术,是指通过模板dna分子的化学修饰,将其锚定在纳米孔或微载体芯片上,利用碱基互补配对原理,在dna聚合酶链反应或dna连接酶反应过程中,通过采集荧光标记信号或化学反应信号,实现碱基序列的解读。ngs最显著特征是高通量,一次性可完成几十万至上百万条序列的测定,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。该技术不需要荧光标记的核酸探针,也不需要进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

罗氏454生命科学公司于2007年推出的gs flx测序系统,是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统,开创了第二代测序技术的先河。

随着ngs技术进步和测序成本的降低、肿瘤医生和病人对ngs检测认知不断完善、测序服务对象和应用细分领域的拓展、企业间合作的增加,ngs有望迎来快速发展。根据美国 markets and markets报告显示,预计全球高通量基因测序市场规模将从2019年的78亿美元增加至2025年的244亿美元,cagr为20.9%。






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