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1、装柱


装柱子(添硅胶)时,常用的有两种方法:即湿法装柱和干法装柱,二者各有优劣。不论干法还是湿法,硅胶(称为固定相更为广义)的上表面一定要平整,并且硅胶(固定相)的高度一般为15cm左右(长度没有绝对之说,根据自身情况而定,制备的大柱可以长达一米),太短了可能分离效果不好,太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

 
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后,再填入柱子中,然后再加压(土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气,当然不加压也可以)用淋洗剂"走柱子",本法最大的优点是一般柱子装的比较结实,没有气泡。 


干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶,然后再轻轻敲打柱子两侧(湿法也要敲的,效果好点),至硅胶界面不再下降为止,然后再填入硅胶至合适高度,最后再用油泵直接抽,这样就会使得柱子装的很结实(一般柱子不敢用油泵抽,怕把柱子抽裂了)。接着是用淋洗剂"走柱子",一般淋洗剂是采用tlc分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压,下面再用油泵抽,这样可以加快速度。干法装柱较方便,但最大的缺陷在于"走柱子"时,由于溶剂和硅胶之间的吸附放热(可以用手摸柱子明显感觉到)(梯度洗脱时,湿法装柱也会出现该情况,比较不好处理,可以缓慢改变溶剂,且置于通风处),容易产生气泡,这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚(用乙醚最最明显),二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉,但是,一旦撤去压力,如在上样、加溶剂等操作的时候,气泡就会释放出来,严重时,整个柱子变花,样品不可能平整地通过,当然也就谈不上分离了。解决的办法是:


第一、硅胶一定要压结实;


第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子",一定要到柱子的下端不再发烫,恢复到室温后再撤去压力。  


也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸,撒上石英砂,再放些棉花),防止添加溶剂的时候,使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样,添加溶剂,则没有这个必要。


2:柱子的尺寸


关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小,反映在柱子上就是样品层比较薄,这样相对的减小了分离的难度。

现在见到的柱子径高比一般在1:5-10,书中写硅胶量是样品量的30-40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开,是指在所需组分rf在0.2-0.4,杂质相差0.1以上,就可以少用硅胶,用小柱子,例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子,如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等关于无水无氧柱,适用于对氧,水敏感,易分解的产品。


3、上样


上样也有干法和湿法之分。


干法(也称硅胶制沙)就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦,但可以保证样品层很平整。(我一般喜欢用这种方法,除非不能用)


湿法上样就是用少量溶剂(最好就是展开剂,如果展开剂的溶解度不好,则可以用一极性较大的溶剂,但必须少量)将样品溶解后,再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后,再加入。


湿法较方便,但不溶剂让其完全被硅胶均匀吸附,不容易跑的很平整。


柱层析关键在于柱子是否装好(这是最大影响因素)和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过tlc确定。这里要指出的一点是:tlc(作用还是很大的)的作用除了跟踪反应进程,检测试剂和原料纯度外,一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。感觉上要使所需点在rf 0.2-0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开就用那种极性过柱子,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式的比较。0.6/0.8一次的分离度,肯定不如0.2/0.3的三次方或四次方大。


4、收集


主要依靠tlc(据说国外有石英柱,直接用荧光灯照能看出来,不过太贵了,在国内不一定适用),需要切记的是:

 
第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时,多尝试几种比例不同,成分不同的展开剂。展开剂的极性太小,点分不开,极性太大,也分不开.一般以目标产物的rf值在0.3左右为最佳。

第二、点不能点得太浓(在最后时应该点的浓点,这样看看有无收尽产品),否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 


第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关,只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。 


选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油迷<己烷<苯<乙醚 展开剂的比例要靠尝试。


一般根据文献(这是首选)中报道的该类化合物用什么样的展开剂,就首先尝试使用该类展开剂,然后不断尝试比例,直到找到一个分离效果好的展开剂。


很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。不行可以尝试两两混合,三者混合,一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果,如果没有分开的迹象,最好是换溶剂。 


在利用tlc跟踪反应时,在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点a,每种难挥发的原料各点一个点b,c, d等等,然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点 一个混合点x,这些点在板上的位置为:a x b c d


这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置,把a这个点展开后的各个层份的 点与b,c,等原料比较,从而判断原料消失没有,点混合点x的目的在于,方便观察,因为有时候,板展开后,各点的位置有些变形,或者由于边缘效应等等,使得判断不易。(我喜欢用小板,跑的快,很快见到结果,为了避免小板的边缘,用机器板较好)


利用tlc判断物质的纯度时,如果不能完全确定,可以再结合其他检测手段,如nmr,因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。


但有趣的是,由于h-nmr可鉴别 的纯度也就在95%左右,有时候h nmr现示较纯的东西,一点板就会发现有几个点。所以,两者要结合使用。如果有标准品或是以前做过的,对个对照最方便。


柱分离操作五大技巧



根据多年来使用柱层析的操作经验,本文总结了在使用柱层析时的几个技巧:


1、 硅胶的使用


初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了,有时还会有大量的硅胶剩余,浪费硅胶,这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是 100-200 目,100 毫升硅胶的质量在47 克左右,如果装一个直径是 2.8 厘米的柱子,可以装 18 厘高。


为了避免浪费硅胶和溶剂,最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单:用量筒量出 100 毫升干硅胶, 直接倒入各种规格的柱子中,敲实,用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度,这样就可以做到心中有数了。


一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量,这样就可以大大地节省硅胶的使用,避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70倍于上样量, 如果极难分, 也可以用100 倍量以上的硅胶。


2、 洗脱剂的使用


洗脱剂的极性可用薄层层析来确定,一般以待分离样品 rf 值为 0.2-0.3 为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质 rf 值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好,如果 rf 在 0.6,即使相差 0.2 也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的过程,可以通过公式的比较:0.6/0.8 一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3) 的三次方或四次方大。


有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好,但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多,所以分离效果好。


解决的办法就是降低洗脱剂的极性,一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时, 可用采梯度洗脱的方法, 即逐渐增加溶剂的极性,使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。


常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统;极性较大的用甲醇:氯仿系统;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物,一是增加柱子的长度和直径,二是减小洗脱剂的极性,这样可以很好地将混合物分开。


在同样能洗脱的情况下,尽量使用毒性小的洗脱剂。例如,乙酸乙酯:石油醚系统和二氯甲烷:石油醚系统, 在同样都能洗脱的情况下,应该用毒性小的乙酸乙酯:石油醚系统。


另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。


这里要注意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化, 一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分,使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。


3、 装柱子的技巧


柱层析的装柱非常重要,装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单,使用也最普遍, 就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆,柱子底部先用脱脂棉塞紧, 然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。


用漏斗将活好的固定相倒入柱子中, 打开底部活塞, 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打, 将固定相敲实, 做到密实均匀无气泡即可。


很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子,而且在柱子中没有气泡产生。


干法装柱与湿法装柱刚好相反的是,它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中, 然后用油泵抽柱子底部, 相当于减压过柱, 直到柱子变得很结实, 再用淋洗剂“走柱子” 。


干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后, 由于溶剂和固定相之间的吸附放热, 所以柱子容易变花,影响分离效果。


解决的方法是:

(1)、固定相一定要添加结实;

(2)、一定要用较多的溶剂“走柱子”,直到柱子的下端不再发烫, 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱,最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。


4、 上样的技巧


上样也有湿法和干法之分:湿法一般用淋洗剂溶解样品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等, 但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。


在不用海沙的情况下, 尽量不要破坏硅胶面。加样后, 打开柱底活塞, 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂,再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。


然后就可以放心地加入大量洗脱剂, 而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的, 一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现, 是因为硅胶对样品的吸附饱和, 而样品本身又是比较好的固体才会析出, 这就需要先重结晶样品, 得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。


如果不能重结晶也没关系,直接过柱就行, 样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解, 最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如 dmf,dmso等, 会随着溶剂一起走, 显色是一个很长的脱尾) , 这时就必须用干法上柱了。


 干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶, 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1:1 的量混合, 硅胶使用的量也可以少一些, 但是要保证在旋干后, 不能看到明显的固体颗粒,让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中, 加入洗脱剂洗脱。


5、 过柱的技巧


柱层析按过柱时的压力可以分为:加压, 常压, 减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度, 减少产品收集的时间, 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的, 但是时间也最长, 例如一些天然化合物的分离,有时一个柱子过几个月也有可能。


减压柱能够减少硅胶的使用量,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发, 有时会在柱子外面有水汽凝结, 另外有些比较易分解的东西可能得不到, 而且还必须同时使用水泵抽气, 噪音大, 时间长, 所以减压过柱用得比较少。


加压过柱是一种比较好的方法, 与常压柱类似, 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵 (用鱼缸供气的加压泵就行)。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。


一般压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高, 分离效果较好, 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。


一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡, 使柱子变花, 利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题, 而且可以使柱子很快装实。


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